高效液相色谱仪的工作原理？

  高效液相色谱仪也叫高压液相色谱、高速液相色谱、高分离度液相色谱等，它是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而快速地发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。

  色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(station phase)发生作用(吸附、分配、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。可以去科邦实验室看看，他们家的仪器种类还挺齐全 质量和售后都是很不错的，我们课题组经常在他家购买耗材

  高效相色谱法是一种分离技术，试样混合物的分离过程（）也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。

  其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。

  当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测的新方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。

  二、基本原理高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。

  （一）高效液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。

  （二）高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。开始样品加在柱头上

  可测项目：大多数都用在有机物、有机污染物、蛋白质、多肽等的分离、定性鉴定和定量分析。可用于恒量分析，其检测限为ppb~ppm级。

  工作原理：主要是基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。

  工作流程：输液泵将流动相（经过在线过滤器）以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在进入色谱柱之前通过自动进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱，在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。

  LC的溶剂包括：自己的流动相，超纯水，体积比为1:1的流动相与超纯水的混合溶液。例如，如果你的流动相是甲醇：水=85:10，那么你要准备的溶剂如下：纯甲醇，50%甲醇水混合溶液。

  溶剂在使用前应当用0.45μm的滤膜过滤，否则易引起色谱柱堵塞，造成柱压过高，从而使测定不能正常进行。

  液相色谱最重要的一点就是整个流路不能有气泡，否则会造成峰分离不好，响应不理想。而使用的溶剂或多或少都会融入空气，故所有溶剂在使用前都要用超声清洗仪脱气15min。

  样品包括标样和实际样品。所有样品的最后性状都应是透明的液体。为避免阻塞，样品同样得用0.45μm的滤膜过滤。

  1.将洗液头放进相应的流动相中，通常标有A的放入纯水中，B泵放入纯有机溶剂中，没有一点标记的洗液头放进50%的有机溶剂水混合液中。

  2.打开主机各模块电源（不分先后），等待机器自检完毕后（“滴”的一声），再双击“INSTRUMENT 1 ONLINE”图标，进入化学工作站；

  4.旋开泵上的排气阀，将工作站中的泵流量设到5ml/min，溶剂A设到100%；

  7.将工作站中的泵流量设到1ml/min，多元泵则再设定溶剂配比，如A=80%，B=20%；

  1）在流量处输入流量,如1ml/min，在溶剂 B处输入70.0(A=100B) ，也可插入一行时间列表 ,编辑梯度。在最大压力极限处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。

  1）在柱温下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击更多键,选中与左侧一致，使柱温箱的温度左右一致。

  1）在波长下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm,在峰宽 (响应时间)下方点击下拉式三角框,选择正真适合的响应时间, 如0.1min(2s)。

  2）在时间列表中可以插入一行，输入随时间切换的波长，如1min，波长=300nm。 3）点击确定进入下一画面。

  5.单击方法菜单，选中保存方法，输入一方法名，如“test”，单击确定。 6 等仪器就绪，基线平稳，从方法菜单中选择运行方法，进样。

  1.关机前，用95%水冲洗柱子和系统0.5-1h，流量0.5—1mL/min，再用100%有机溶剂冲0.5h，然后关泵，（适于反相色谱柱）。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]

  5.长时间不使用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不可以用纯水冲洗及保存柱子，而应该用有机相（如甲醇等），因为纯水极性太强且易长霉。

  8.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边清洗，然后插入新的流动相中。