超酷炫的动图解释色谱原理看完就秒懂了

  色谱（chromatography）是分析测试物质理化性质的常用的有效手段，多用于生物分子及高聚物的分离检测等。

  分析色谱、制备色谱的共同的鼻祖是高效液相色谱(High Pe-rformance Liauid Chromatography，HPLC)，高效液相色谱的优点是：(1)、分辩率高于其它色谱法；(2)、速度快，十几分钟到几十分钟内可完成；(3)、实验重复性高；(4)、高效相色谱柱可反复使用；(5)、自动化操作，分析精确度高。

  根据用途不一样，逐渐区分出来：分析型用来做样品定性，纯度检测的，即为分析色谱；制备型是用来快速分离和纯化产品的，即为制备色谱。

  分析色谱：要求分离度高、速度快，分离的容量自然而然就要降低，获得样品的量很少，一般依次能够获得1mg样品；制备色谱，制备富集是目的，要求高容量，分离度和速度自然就会降低，获得样品可以是分析色谱的几倍、几百倍以及上千倍，一般简单一次得到的样品量不少于100mg。

  分析色谱是制备色谱的基础。当我们在分析色谱上取得了良好的分离效果时，可以将其放大，应用到制备色谱上。将分析色谱的进样量增大，同时得出大量的所需物质（馏分）的过程就可以称为制备色谱。分析色谱的目的，是分析出混合物中一个（或者几个）纯物质的含量。制备色谱的目的，是从混合物中得到纯物质。为了加快分离的时间与提高分离的效率，制备色谱的的进样品量很大，导致制备色谱柱子的分离负荷的相应加大，也就必须加大色谱柱填料，增大制备色谱的直径和长度，使用的相对多的流动相。

  制备色谱与分析色谱差别较大在于精度。制备色谱为了获得分离物质的纯度和量，适当的放弃了对精度的苛求。制备色谱当做分析色谱用，应该要针对具体的样品情况而定。样品较易分离时，制备色谱还是能当分析色谱使用。

  分析色谱：在乎分析结果,对化验结果的纯度,比例等要求准确，而对收率，浓度等产品参数不在乎，一次进料，而且每次进料少；制备色谱：比较在乎高效能得到纯化物质。

  色谱包含多种操作方法不一样但原理相同的分离、分析技术。按其流动相和固定相状态不同分为气相色谱和液相色谱。今天，随测了么小编来看一下色谱仪具体是怎么工作的吧！

  以气相色谱仪为例，主要由三大部分构成：载气、色谱柱、检测器。每一模块具体工作流程如下。

  体积排阻色谱法（SEC）是利用多孔凝胶固定相的独特特性，主要是根据分子尺寸大小的差异来进行分离的方法，样品分子与固定相之间不存在相互作用。

  根据所用凝胶的性质，可大致分为使用水溶液的凝胶过滤色谱法（GFC）和使用有机溶剂的凝胶渗透色谱法（GPC）。

  原理：色谱固定相是多孔性凝胶，只有直径小于孔径的组分能进入凝胶孔道。大组分不能进入凝胶孔洞而被排阻，只能沿着凝胶粒子之间的空隙通过，因而最大的组分最先被洗提出来。

  小组分可进入大部分凝胶孔洞，在色谱柱中滞留时间长，会更慢被洗提出来。溶剂分子因体积最小，可进入所有凝胶孔洞，因而是最后从色谱柱中洗提出。这也是与其他色谱法最大的不同。

  体积排阻色谱法适用于对未知样品的探索分离。凝胶过滤色谱适于分析水溶液中的多肽、蛋白质、生物酶等生物分子；凝胶渗透色谱大多数都用在高聚物（如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯）的分子量测定。

  离子交换色谱是利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现组分分离。

  原理：固定相为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心。流动相最常使用水缓冲溶液，也有有机溶剂如甲醇，或乙醇同水混合。

  流动相带着样品组分电离生成的离子通过固定相时，待分离组分中的离子与树脂分子结构中可电离的活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。

  固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。

  亲和色谱法是利用与固定相不同程度的可逆结合的亲和性，使成分与杂质分离的色谱法。固定相为相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一。

  不同分子与固定相间亲和力大小有差异，选择适当的洗脱条件便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。

  主要用于分离活体高分子物质、过滤性病毒及细胞。优点是操作简单便捷、效率高、条件温和，缺点是使用局限性大。

  相对分子质量在200～2000的化合物，可用液-液分配色谱仪、液-固吸附色谱仪和离子交换色谱仪剖析。

  含有离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（如配位体和有机螯合剂），可首要考虑用离子交换色谱仪，或液-液分配色谱仪和凝胶色谱仪。

  气相色谱：气相色谱是一种物理的分离方法。利用被测物质各组分在不同两相间分配系数(溶解度)的微小差异，当两相作相对运动时，这些物质在两相间进行反复多次的分配使原来只有微小的性质差异产生很大的效果而使不同组分得到分离。

  液相色谱：高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上引用了气相色谱的理论。在技术上，流动相改为高压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万)；同时，柱后连有高灵敏度的检测器可对流出物进行连续检测。

  受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法做多元化的分析，一般对500℃以下不易挥发或受热易分解的物质部分可采用衍生化法或裂解法。

  液相色谱：高效液相色谱法只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此，不受试样挥发性的限制。对于高沸点、耐热性差、相对分子量大(大于400以上)的有机物(些物质几乎占有机物总数的75%~80%)原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中能用气相色谱分析的约占20%而能用液相色谱分析的约占70~80%。

  由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统组成。进样部分、色谱柱和检测器的温度均在控制状态。

  色谱柱是气相色谱仪的心脏，样品中的各个组份在色谱柱中经过反复多次分配后得到分离进而达到分析的目的，柱箱的作用就是安装色谱柱。由于色谱柱的两头分别连接进样器和检测器，因此，进样器和检测器的下端(接头)均插入柱箱。柱箱能够安装各种填充柱和毛细管柱，并且操作方便。色谱柱(样品)需要在一定的温度条件下工作，因此，采用微机对柱箱进行温度控制。并且由于设计合理，柱箱内的梯度很小。

  对于一些成份复杂、沸程较宽的样品，柱箱还可进行三阶程序升温控制。且程序设定后自动运行无需人工干预，降温时还能自动后开门排热。

  进样器的作用是将样品送入色谱柱。如果是液体样品，进样器还必须将其汽化。因此，采用微机对进样器进行温度控制。

  检测器也需要在一定的温度条件下才能正常工作，因此，采用微机对检测器进行温度控制。

  该系统可对测试数据来进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。

  高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统组成。

  该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l.47~4.4X107Pa流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变包括改变洗脱液的极性、离子强度、pH值或改用

  色谱柱一般长度为10~50cm(需要两根连用时，可在二者之间加一连接管)内径为2~5mm，由优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制造成，柱内装有直径为5~10μm粒度的固定相(由基质和固定液构成)，固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性(如，硅胶表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍(与气相色谱中固定相的制备一样)或者用化学法偶联各种基因(如，磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等)或配体的有机化合物。

  因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性，例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。

  另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小、微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。

  这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60℃通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。

  其特点:使用面广(如，蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用)；灵敏度较高(检测下限为10-10g/mL)；线性范围宽;对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。

  凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。糖类化合物的检测使用此检测系统。这一系统通用性强、简单易操作，但灵敏度低(检测下限为10-7g/mL)流动相的变化会引起折光率的变化。因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。

  凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机物(如，多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等)的测定，它的灵敏度很高(检测下限为10-12~10-14g/mL）痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。

  该系统可对测试数据来进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。